一代测序和二代测序区别(一代测序和二代测序原理)

一代测序和二代测序原理

二代测序相比一代测序大幅降低了成本，保持了较高准确性，并且大幅降低了测序时间，将一个人类基因组从3年降为1周以内，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多，这也给三代测序提供了发展空间。

一代测序：又称Sanger测序

原理：ddNTP的2＇和3＇都不含羟基，其在DNA的合成过程中不能形成磷酸二酯键，可以用来中断DNA合成反应。在4个DNA合成反应体系（含dNTP）中分别加入一定比例带有标记的ddNTP（分别为ddATP、ddCTP、ddGTP和ddTTP），通过凝胶电泳和放射自显影后可以根据电泳带的位置确定待测分子的DNA序列。

二代测序：NGS技术（多分子，多克隆）

背景：Sanger测序虽读长较长、准确性高，但由于其测序成本高、通量低等缺点，难以在de novo测序、转录组测序等方面普及应用。经过不断的技术开发和改进，以Roche公司的454技术、illumina公司的Solexa、Hiseq技术，ABI公司的Solid技术为标志的第二代测序技术诞生，后起之秀Thermo Fisher的Ion Torrent技术近年来也杀入历史舞台。

1、Illumina 原理：

桥式PCR+4色荧光可逆终止+激光扫描成像

主要步骤：

①DNA文库制备—超声打断加接头

②Flowcell—吸附流动DNA片段

③桥式PCR扩增与变性—放大信号

④测序—测序碱基转化为光学信号

特点：Illumina的这种测序技术每次只添加一个dNTP的特点能够很好的地解决同聚物长度的准确测量问题，它的主要测序错误来源是碱基的替换。而读长短（200bp-500bp）也让其应用有所局限。

2、Roche 454

油包水PCR + 4种dNTP车轮大战 + 检测焦磷酸水解发光

一代测序和二代测序原理图解

第二代DNA测序技术又称下一代测序技术，是对第一代测序技术的划时代变革的核心。

现有的技术平台主要包括Roche/454 GS FLX、Illumina/Sol-exa GenomeAnalyzer、Helicos BioSciences公司的HeliScope™ Single Molecule Sequencer、美国Dana-her Motion公司推出的Polonator；以及连接法测序 (sequencing by ligation)，即通过引物来定位核酸信息，技术平台有Applied Biosystems/SOLiD™ system。以上技术平台所运用的测序原理均为循环微阵列法

一代测序和二代测序的原理与异同

焦磷酸测序技术应用存在的问题： 该技术的原理上来讲，对于多个单碱基重复的序列的准确性比较低（因为焦磷酸测序是一次加入一种碱基，所有荧光信号区分AAAA中到底有几个A是比较不准确的） 通量低，当然这个是市场所给定义的，以前illumina测序GA的时候，也没觉得其他通路有多低，但是现在PGM，next500 MISEQ，HISEQ 这一些列的测序的通量大大提高，使得其他通量显得应用中很难有发挥，现在出来种群多样性鉴定中还比较好用（说实话也被miseq给占了一半还多），454越来越少了。

其实焦磷酸测序这个技术应用在非二代测序中也有一定应用，比如甲基化的验证（现在焦磷酸测序是甲基化位点验证的金标准）

一代测序跟二代测序的区别

NGS又叫高通量测序，主要优势就是通量大，可以得到海量的数据。一代测序一次只能产生1K的数据。高通量最小的数据量单位也是G。

一代测序和二代测序原理一样吗

一代基因指的是一代DNA测序技术，第一代测序技术主要基于化学降解法和双脱氧链终止法的原理，配合放射性同位素标记、凝胶电泳和放射自显影测定DNA序列；

二代基因，二代DNA测序技术，也称为高通量测序技术，可以一次针对几十万到几百万条DNA分子进行并行测定，极大地增强了测序的检测通量，降低了测序成本并缩短了检测时间。而且二代测序技术是最不可能由于操作不当、缺失、稀有转录及克隆细菌不稳定的原因而产生错误的

一代测序与二代测序的区别

二代测序诞生在2005年左右，被称为“Next-generation sequencing”技术，简称NGS.

一代测序和二代测序的应用

scaffold

其实是基因组组装时的概念。涉及到的相关概念如下：

reads

：就是我们测序产生的短读序列，通常一代和三代的reads读长在几千到几万bp之间，二代的相对较短，平均是几十到几百bp。

contig

：中文叫做重叠群，就是不同reads之间的overlap交叠区，拼接成的序列就是contig

scaffold

: 是比contig还要长的序列，获得contig之后还需要构建paired-end或者mate-pair库，从而获得一定片段的两端序列，这些序列可以确定contig的顺序关系和位置关系，最后contig按照一定顺序和方向组成scaffold，其中形成scaffold过程中还需要填补contig之间的空缺。

一代测序和二代测序哪个好

而第二代测序技术大大降低了测序成本的同时，还大幅提高了测序速度，并且保持了高准确性。有助于人们以更低廉的价格，更全面、更深入地分析基因组、转录组及蛋白质之间交互作用组的各项数据。以前完成一个人类基因组的测序需要3年时间，而使用二代测序技术则仅仅需要1周，但在序列读长方面比起第一代测序技术则要短很多。

第二代测序技术最显著的特征是高通量, 一次能对几十万到几百万条DNA 分子进行序列测序, 使得对一个物种的转录组测序或基因组深度测序变得方便易行。新一代测序技术将片段化的基因组DNA 两侧连上接头, 随后用不同的方法产生几百万个空间固定的PCR 克隆阵列。每个克隆由单个文库片段的多个拷贝组成。然后进行引物杂交和酶延伸反应。由于所有的克隆都在同一平面上, 这些反应就能够大规模平行进行, 每个延伸反应所掺入的荧光标记的成像检测也能同时进行, 从而获得测序数据。 DNA 序列延伸和成像检测不断重复, 最后经过计算机分析就可以获得完整的DNA序列信息。